蛋白穩定性分析儀PSA-16助力齊魯工業大學（山東省科學院）生物研究所的科研工作者于 2025年4月在《International Journal of Biological Macromolecules》期刊上發表“Structural-guided high stable fusion urate oxidase engineering to self-assemble with cellulose modified electrode for enhanced uric acid sensing”論文。

Xingbao Wang, Weili Gong, Yunlong Xue, Yi Yu, Xiaozhen

01 前言

在固定化尿酸氧化酶（UOX）的高穩定性和保留的催化活性是實現尿酸（UA）精確傳感器的關鍵。本研究開發了一種基于自組裝固定化UOX的電化學UA生物傳感器，通過在纖維素修飾電極上融合碳水化合物結合模塊（CBM）來促進UA的檢測。借助計算結構導向的酶工程策略，證明了N端CBM3融合的結構穩定性優于C端融合的CBM3或CBM2。進一步刪除了預測對CBM3-UOX結構穩定性有害的CBM3 N端殘基（P2VSG5）和連接區殘基（K158EPMSN163），構建了CBM3-Δ10aa-UOX，與戊二醛交聯的UOX生物傳感器（0-0.375 mM，5天）相比，顯著提高了UA生物傳感器的可靠性，在0至0.625 mM UA范圍內表現出線性關系，R2 > 0.99，可持續20天。此外，通過野生型UOX和CBM3-Δ10aa-UOX的共固定化（0-0.875 mM，> 34天，R2 > 0.99），探究了融合UOX在初始階段電流增加的機制，并將其歸因于UOX亞基之間的相互作用和連接肽斷裂，進一步證明了CBM3-Δ10aa-UOX連接肽的增強穩定性可延長電流增加過程并提高工作壽命。本研究強調了自組裝固定化在推進生物傳感器領域的有效性，并為類似多聚體生物傳感器的進化提供了穩健的策略。

02 摘要

尿酸（UA）是一種在血清和尿液等生物體液中廣泛存在的關鍵含氮化合物，是嘌呤代謝的主要終產物。健康個體血清中UA的正常水平分別為成年男性約0.21-0.43 mM和成年女性約0.15-0.36 mM，而在痛風患者中，UA濃度可高達1.49-4.46 mM。生物體液中UA水平的異常可提示痛風、代謝綜合征和腎臟疾病等疾病，使其成為檢測嘌呤代謝相關疾病的有用生物標志物。因此，生物體液中UA的快速可靠檢測通常對其診斷和治療至關重要。

目前，已開發出多種UA測定方法，包括高效液相色譜法（HPLC）、分光光度法、離子色譜法、HPLC/同位素稀釋質譜法（ID-MS）和電化學生物傳感方法。在這些方法中，基于尿酸氧化酶（UOX或尿酸酶，EC 1.7.3.3）氧化還原催化的電流型酶生物傳感器因其簡單性、靈敏度、特異性和快速響應而受到廣泛研究關注。UOX反應方程式如下：UA + 2H2O + O2 → 尿囊素 + H2O2 + CO2。在生物傳感過程中，固定在電極上的UOX與UA反應，消耗O2并產生H2O2。減少的O2或氧化的H2O2與UA濃度成正比，氧化或還原信號可通過換能器和電子放大器轉換并放大為可讀的物理信號。因此，固定化UOX的高穩定性和保持的催化活性是實現UA精確傳感的關鍵。

在先前報道的研究中，已利用不同類型的酶固定化技術構建電流型UA生物傳感器。物理吸附和包埋法常用于UOX固定化，但其吸附過程的結合力較弱，易受環境變化影響，從而降低相應生物傳感器的操作和儲存穩定性。UOX包埋通常使用聚苯胺（PANi）和聚吡咯等聚合物實現。然而，固定化酶從這些聚合物中的泄漏可能影響其穩定性。使用戊二醛或碳二亞胺等雙功能試劑在酶與載體或牛血清白蛋白（BSA）之間形成穩定共價鍵的共價結合和交聯方法也是化學固定UOX的常用方法，可避免酶的解吸和泄漏。然而，共價結合法引起的廣泛酶失活和低重復性限制了其在生物傳感器中的應用。最近，親和吸附法已被證明是一種有前景的酶固定化策略，可提高酶生物傳感器的性能。此外，通過基因工程將來自家族2的碳水化合物結合模塊（CBM2）與葡萄糖氧化酶融合，以促進葡萄糖傳感性能。然而，UOX的結構和催化機制與葡萄糖氧化酶不同，因此探索構建穩定且具有活性的CBM融合UOX作為UA生物傳感元件仍然至關重要。

UOX是一種功能性四聚體桶狀結構，其活性位點由來自兩個單體的界面殘基形成。每個單體包含兩個具有ββααββ反平行超二級結構的相同結構域，稱為隧道折疊結構域。某些弱相互作用（非共價鍵、次級鍵），包括范德華力、氫鍵、鹽鍵（解離鍵）和疏水相互作用，參與穩定四級結構。此外，亞基之間形成的緊密界面處極性和疏水基團的互補排列促進了特定亞基的關聯。在UOX催化過程中，采用無輔因子方式促進和控制O2化學，提出了類似于黃素依賴性氧化酶或黃素依賴性單加氧酶的不同催化機制，但其作用機制尚未闡明。由于UOX的多亞基依賴性催化活性和模糊的催化機制，過去幾十年中關于性能改進的工程化UOX的研究報道較少。因此，構建穩定的基因融合UOX是一項重大挑戰。

串聯融合是構建合成融合蛋白的一種流行且可行的策略。使用該策略獲得理想的融合蛋白時，應仔細考慮兩個的要素：融合伙伴之間的最佳結構域放置順序和選擇合適連接子將蛋白質結構域連接在一起。融合蛋白的盲目設計可能導致多種不良后果，包括結構域錯誤折疊、蛋白質產量低和生物活性降低。由于專門用于蛋白質結構預測和蛋白質合理設計的計算程序（如AlphaFold2、PROCHECK、AutoDock Vina和GROMACS ）的顯著發展，可以更好地理解融合蛋白結構并避免許多不良結果。

03 結果

為了對所有UOXs進行更全面的結構表征，作者采用了差示掃描熒光法（DSF）[34]進行熱穩定性測定。如圖S7所示，UOX-CBM3和UOX-CBM2的峰形更為不對稱，尤其是UOX-CBM2，這表明CBM與UOX斷裂誘導了多個結構域的協同變性。相比之下，CBM3-Δ10aa-UOX的DSF峰最為對稱且最窄，驗證了其結構穩定性，這與分子動力學模擬和SDS-PAGE分析的結果一致。

04 方法

使用北京佰司特科技有限責任公司生產的 PSA-16 蛋白穩定性分析儀對目標蛋白的熱穩定性進行了評估。首先將樣品稀釋至 0.5 毫克/毫升的濃度。然后，將 20 微升稀釋后的樣品置于石英玻璃管（產品編號 LG-002，同樣來自北京佰司特科技有限責任公司）中。

采用線性溫度掃描法，測量 330 nm和 350 nm處的內源性蛋白質熒光強度。溫度范圍為 23 至 97 ℃，升溫速率為每分鐘 1 ℃。根據 F350/F330 曲線的斜率計算出熱變性中點溫度（Tm）。每個樣品均重復測量四次。

05 結果

在本研究中，作者借助結構引導的酶工程策略構建了一系列CBM融合尿酸氧化酶，并探索了影響融合UOX作為生物傳感元件穩定性的關鍵因素，結果表明CBM3 N端連續殘基（P2、V3、S4、G5）和158至163位（K158EPMSN163）域間錨定區域對CBM融合UOX結構穩定性的關鍵作用。刪除不穩定殘基后，UA生物傳感器的可靠性顯著提高。本研究有助于合理構建具有可調和可預測特性的融合UOX，并為制造優異的UA生物傳感器提供了理想候選者。

為了對所有 UOX 進行更全面的結構表征，作者使用差示掃描熒光法（DSF）[34] 進行了熱穩定性測定。如圖 S7 所示，UOX-CBM3 和 UOX-CBM2 的峰形更不對稱，尤其是 UOX-CBM2，這表明由于 CBM 和 UOX 的斷裂，多個結構域協同變性。相比之下，CBM3-Δ10aa-UOX 的差示掃描熒光（DSF）峰最對稱且最窄，這證實了其結構穩定性，正如分子動力學（MD）模擬和十二烷基*-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析所表明的那樣。